归一化 - 单细胞最佳实践

步骤

yml

安装 conda：
- 在创建环境之前，请确保 conda 已安装在你的系统中。
保存 yml 内容：
- 将 yml 选项卡中的内容保存为文件 environment.yml。
创建环境：
- 打开终端或命令提示符。
- 运行以下命令：
```
conda env create -f environment.yml
```
激活环境：
- 创建好环境后，使用以下命令激活它：
```
conda activate <environment_name>
```
- 请将 <environment_name> 替换为 environment.yml 文件中指定的环境名称。该名称在 yml 文件中如下所示：
```
name: <environment_name>
```
验证安装：
- 通过运行以下命令，检查环境是否创建成功：
```
conda env list
```

surface_protein.yml

name: surface-protein
channels:
  - conda-forge
dependencies:
  - python=3.13
  - scanpy=1.12
  - muon=0.1.9
  - python-igraph=1.0.0
  - ipykernel=7.2.0
  - pip==26.0.1
  - pip:
      - lamindb==2.3.1
      - harmonypy==0.0.9
      - ipywidgets==8.1.8

本书使用 lamindb 存储、共享和加载数据集与笔记本，托管实例为 theislab/sc-best-practices。感谢提供免费托管的 Lamin Labs。

安装 lamindb
- 安装 lamindb Python 软件包：
```
pip install lamindb
```
可选择创建 Lamin 账户
- 按照说明注册并登录
验证你的设置
- 下面用 Python API 检查连接；命令行方式可使用 lamin connect：
```
import lamindb as ln

ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").df()
```
运行后应显示最多 100 条已保存的数据集记录。
访问数据集（Artifact）
- 在 Artifacts 页面搜索数据集
- 加载一个 Artifact 及其对应的对象：
```
import lamindb as ln
af = ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get(key="key_of_dataset", is_latest=True)
obj = af.load()
```
加载后的对象可直接在内存中分析。如需指定数据版本，可调整 lamindb.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get("SOMEIDXXXX") 中的 ID。
访问笔记本（Transform）
- 在 Transforms 页面搜索笔记本
- 加载笔记本：
```
lamin load <notebook url>
```
该命令将笔记本下载到当前工作目录。与 Artifacts 类似，可通过指定 ID 获取旧版本。

研究动机¶

通过测序对转录组和表位进行细胞索引（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing, CITE-seq）得到的抗体衍生标签（Antibody-Derived Tags, ADTs）也包含技术变异。主要来源包括细胞间测序深度差异、抗体非特异性结合，以及游离标签抗体等产生的背景信号。归一化（normalization）旨在减轻这些因素对分析的影响。

相较于常见的 RNA 计数（Count）数据，ADT 通常较不稀疏，许多标记呈现阴性背景峰与阳性信号峰。这里的“阴性”指缺乏特异性蛋白信号，并不是 Count 为负 Zheng et al., 2022。细胞生物物理性质会影响抗体捕获，而预先选定、规模较小的特征（feature）面板也容易受到组成性偏差（compositional bias）的影响。

ADT Count 为什么具有组成性

在有限的测序资源下，每个细胞的读段（Read）分配到预设抗体面板中的各个标签。某个标记占据较大比例时，其他标记的相对份额就可能降低，即使其实际蛋白量没有变化。因此，ADT Count 不能直接等同于细胞携带的蛋白分子数。

小型抗体面板若由少数强信号标记主导，这种效应尤其明显；RNA 测量覆盖的基因较多，但也并非没有组成性偏差。下文将介绍基于比值的尺度变换，以及利用背景和技术协变量进行校正的两类方法，两者原理不同。

ADT 有多种归一化方法，本章介绍两种常用选择。

传统方法是中心化对数比（Centered Log-Ratio, CLR）变换 Stoeckius et al., 2017，本章后半部分将演示其应用。另一种针对 ADT 背景设计的方法是背景去噪与缩放（Denoised and Scaled by Background, dsb）Mulè et al., 2022，其主要步骤如下：

首先，利用空液滴（empty droplet）估计各抗体的背景信号。ADT 背景主要与游离标签抗体及其他非特异性信号有关，不能简单理解为细胞外蛋白的总量。默认步骤在加伪计数并取对数后，减去相应空液滴背景均值，再除以背景标准差。
其次，估计并回归细胞层面的技术成分。同型对照（isotype controls）可与细胞内阴性蛋白的背景估计共同提供技术协变量。同型对照应与实验抗体的宿主和同型匹配，并且不针对样本中的特异靶抗原；它们用于衡量非特异性背景，而不是专门识别许多蛋白。

环境设置¶

import warnings

import matplotlib.pyplot as plt
import muon as mu
import pandas as pd
import scanpy as sc
import seaborn as sns

warnings.filterwarnings("ignore")
sc.settings.verbosity = 0
sc.set_figure_params(dpi=80, facecolor="white", frameon=False)

import lamindb as ln

ln.track()

→ connected lamindb: theislab/sc-best-practices
→ found notebook normalization.ipynb, making new version -- anticipating changes
→ created Transform('Z95qTilYUzGh0005', key='normalization.ipynb'), started new Run('kGh9gDK6yaGvesDT') at 2026-07-29 10:39:11 UTC
→ notebook imports: lamindb-core==2.3.1 matplotlib==3.11.1 muon==0.1.9 pandas==2.3.3 scanpy==1.12.3 seaborn==0.13.2
• recommendation: to identify the notebook across renames, pass the uid: ln.track("Z95qTilYUzGh")

加载数据¶

加载前一章保存的 MuData 对象，参见质量控制：

af = ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get(
    key="surface-protein/cite_quality_control.h5mu",
    is_latest=True,
)
mdata = af.load()
mdata

dsb 还需要包含背景液滴的未过滤数据。mdata_raw 是包含全部液滴的 MuData 对象；mdata 则仅保留通过 Cell Ranger 和本教程质控的条形码（Barcode）。本例未过滤对象包含超过 2,400 万个液滴，质控后对象包含 106,515 个细胞。

af_raw = ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get(
    key="surface-protein/cite_raw.h5mu",
    is_latest=True,
)
mdata_raw = af_raw.load()
mdata_raw

mdata["prot"].layers["counts"] = mdata[
    "prot"
].X.copy()  # saving the raw data in a layer.

dsb 归一化¶

dsb 归一化 Mulè et al., 2022 利用背景数据减少 ADT 技术噪声。本例同时提供未过滤数据中的空液滴和同型对照。缺少同型对照时，muon 仍可根据细胞内阴性蛋白背景估计技术成分，不必机械地只保留第一步；但本章不演示这种配置。若缺少可用的背景液滴，本例的背景缩放步骤无法直接照用，可考虑后文的 CLR。

同型对照不应呈现由目标抗原驱动的特异信号，其细胞间变化可帮助估计技术差异。不过，对照信号也可能随细胞性质变化，因此应检查其适用性，不能假定所有细胞中的信号必然一致。

先查看未过滤数据的 RNA 总 Count 分布，以辅助区分候选空液滴与含细胞液滴。

sc.pp.calculate_qc_metrics(mdata_raw["rna"], inplace=True, percent_top=None)
sns.displot(
    mdata_raw["rna"]
    .obs.sample(frac=0.01)
    .query("total_counts<100000 and total_counts>10"),
    x="total_counts",
    log_scale=True,
    hue="donor",
    multiple="stack",
)

<seaborn.axisgrid.FacetGrid at 0x7f5154351400>

本例在 10^1 到 10^2.1 附近的低 Count 峰主要对应候选空液滴。mdata 保存过滤后的细胞，mdata_raw 则包含含细胞及不含细胞的液滴。下方调用没有显式传入 empty_counts_range：在 muon v0.1.9 中，此时将未出现在 mdata 中的液滴作为背景。因此，代码并未直接按图中的区间筛选空液滴，背景集合也可能包括被质控去除的细胞，使用时需核对其组成。

列出用于技术成分估计的同型对照。

isotype_controls = ["Mouse-IgG1", "Mouse-IgG2a", "Mouse-IgG2b", "Rat-IgG2b"]

调用 muon.prot.pp.dsb，传入过滤后的 MuData、未过滤的 MuData，以及同型对照名称。

mu.prot.pp.dsb(mdata, mdata_raw, isotype_controls=isotype_controls, random_state=0)

先查看保存在 counts 层中的原始 Count。

pd.Series(mdata["prot"].layers["counts"][:100, :100].toarray().flatten()).value_counts()

1.0      1048
0.0      1026
2.0       898
3.0       688
4.0       581
         ... 
347.0       1
390.0       1
344.0       1
565.0       1
621.0       1
Name: count, Length: 543, dtype: int64

再查看 dsb 处理后的数值。这些值表示背景校正后的相对表达，可以为负，已不再是原始 Count。

pd.Series(mdata["prot"].X[:100, :100].flatten()).value_counts()

8.529189     2
1.581845     1
8.613171     1
14.779234    1
7.079424     1
            ..
8.519451     1
2.257648     1
7.581913     1
40.300850    1
6.755094     1
Name: count, Length: 9999, dtype: int64

下面分别绘制每个细胞的原始 ADT 总 Count，以及 dsb 处理后各标记数值之和。两者量纲不同，不能直接当作相同尺度的蛋白总量比较：

sns.histplot(mdata["prot"].layers["counts"].sum(axis=1), bins=50)
plt.title("Total counts per cell (raw)")
plt.xlim(0, 20000)

(0.0, 20000.0)

原始 ADT 总 Count 在细胞间差异较大。测序深度、游离抗体背景及非特异性结合都可能贡献这些差异，真实蛋白水平和细胞大小也会产生影响。

sns.histplot(mdata["prot"].X.sum(axis=1), bins=50)
plt.title("Total counts per cell (dsb normalized)")

dsb 处理后的分布范围发生变化，说明数值尺度及背景成分已被调整；仅凭分布收窄，不能判定剩余差异全部来自生物学，也不能量化噪声消除程度。

CLR 归一化¶

缺少背景数据或希望比较其他方法时，可使用 muon.prot.pp.clr 进行 Centered Log-Ratio 归一化。这一方法最初用于原始 CITE-seq 研究 Stoeckius et al., 2017。

CLR 类变换可减轻细胞间 ADT 总量差异对降维（dimensionality reduction）和聚类（clustering）的影响，但不直接估计游离抗体背景。本例使用 muon 默认的 seurat 变体：先计算每个细胞中各蛋白的 log(1 + Count) 均值并取指数，作为几何参考尺度，再计算 log(1 + Count / 参考尺度)。这与无伪计数的标准 CLR 不同，也不保证每个细胞变换后的数值总和相等。

mdata_clr_normalize = mdata.copy()
mdata_clr_normalize["prot"].X = mdata_clr_normalize["prot"].layers["counts"].copy()

先将原始 Count 复制到独立对象，再调用 muon.prot.pp.clr：

mu.prot.pp.clr(mdata_clr_normalize["prot"], axis=1)

本章推荐 axis=1，即对每个细胞沿蛋白维度计算参考尺度，以减轻细胞间总量差异。axis=0 则对每个蛋白沿细胞维度计算参考尺度，两者回答的问题不同。小面板或具有相近总体分布的标记可考虑后者，但选择应依据实验和下游目标，而非只看归一化后分布是否接近。这里的轴定义特指 muon，不应直接套用其他软件的同名参数。

从 muon 0.1.8 起，clr 提供 flavor 参数。本例使用默认 flavor="seurat"；flavor="stoeckius" 则先加 1 再按标准对数比形式变换，结果可为负，并会转为稠密矩阵。不同变体的数值含义和内存需求不同，复现时应记录具体设置。

比较原始 Count 与 CLR 处理后的数值：

pd.Series(mdata["prot"].layers["counts"][:100, :100].toarray().flatten()).value_counts()

1.0      1048
0.0      1026
2.0       898
3.0       688
4.0       581
         ... 
347.0       1
390.0       1
344.0       1
565.0       1
621.0       1
Name: count, Length: 543, dtype: int64

pd.Series(mdata_clr_normalize["prot"].X[:100, :100].toarray().flatten()).value_counts()

0.000000    1026
0.172764      20
0.163880      19
0.160785      18
0.166124      17
            ... 
2.751836       1
1.074037       1
1.052570       1
1.923326       1
4.267047       1
Name: count, Length: 4092, dtype: int64

绘制每个细胞的 CLR 数值之和：

sns.histplot(mdata_clr_normalize["prot"].X.sum(axis=1), bins=50)
plt.title("Total counts per cell (CLR normalized)")
plt.xlim(0, 400)

(0.0, 400.0)

本例多数细胞的 CLR 数值之和约为 50–150，较原始图中 0–20,000 的 Count 范围更集中。由于变换改变了数值尺度，两个范围不能直接比较为相同单位的总量，也不能仅凭范围缩小证明技术噪声已被去除。

本例具备背景液滴和同型对照，因此后续继续使用 dsb 处理的对象，并将其保存。

af_normalization = ln.Artifact.from_mudata(
    mdata,
    key="surface-protein/cite_normalization.h5mu",
    description="CITE-seq data after normalization",
)
af_normalization.save()

→ returning artifact with same hash: Artifact(uid='1gDVbNOjKn0egsqm0003', key='surface-protein/cite_normalization.h5mu', description='CITE-seq data after normalization', suffix='.h5mu', kind='dataset', otype='MuData', size=1467018249, hash='PntBph8LObdvBIRlb7XKEm', n_files=None, n_observations=106515, branch_id=1, created_on_id=1, space_id=1, storage_id=1, run_id=98, schema_id=None, created_by_id=7, created_at=2026-07-29 10:21:13 UTC, is_locked=False, version_tag=None, is_latest=True); to track this artifact as an input, use: ln.Artifact.get()

Artifact(uid='1gDVbNOjKn0egsqm0003', key='surface-protein/cite_normalization.h5mu', description='CITE-seq data after normalization', suffix='.h5mu', kind='dataset', otype='MuData', size=1467018249, hash='PntBph8LObdvBIRlb7XKEm', n_files=None, n_observations=106515, branch_id=1, created_on_id=1, space_id=1, storage_id=1, run_id=98, schema_id=None, created_by_id=7, created_at=2026-07-29 10:21:13 UTC, is_locked=False, version_tag=None, is_latest=True)

ln.finish()

• please hit CTRL + s to save the notebook in your editor ... ✓
→ finished Run('kGh9gDK6yaGvesDT') after 15m at 2026-07-29 10:54:55 UTC
→ go to: https://lamin.ai/theislab/sc-best-practices/transform/Z95qTilYUzGh0005
→ to update your notebook from the CLI, run: lamin save /groups/nils/members/javier/single-cell-best-practices/jupyter-book/surface_protein/normalization.ipynb

贡献者¶

我们衷心感谢以下人员的贡献：

作者¶

Javier Marchena-Hurtado
Daniel Strobl
Ciro Ramírez-Suástegui

审阅者¶

Lukas Heumos
Anna Schaar

References¶

Zheng, Y., Jun, S.-H., Tian, Y., Florian, M., & Gottardo, R. (2022). Robust Normalization and Integration of Single-cell Protein Expression across CITE-seq Datasets. bioRxiv. 10.1101/2022.04.29.489989
Stoeckius, M., Hafemeister, C., Stephenson, W., Houck-Loomis, B., Chattopadhyay, P. K., Swerdlow, H., Satija, R., & Smibert, P. (2017). Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods, 14(9), 865–868. 10.1038/nmeth.4380
Mulè, M. P., Martins, A. J., & Tsang, J. S. (2022). Normalizing and denoising protein expression data from droplet-based single cell profiling. Nature Communications, 13(11), 2099. 10.1038/s41467-022-29356-8