单细胞 ATAC-seq

研究动机¶

同一生物体的大多数体细胞拥有基本相同的基因组，却能形成免疫系统中的自然杀伤细胞、传递电化学信号的神经元等功能迥异的细胞。前几章介绍了如何根据基因表达谱推断细胞身份与功能。基因表达受 DNA 甲基化（DNA methylation）、组蛋白修饰（histone modification）以及转录因子（Transcription Factor, TF）活性等多种机制共同调控。染色质 可及性（chromatin accessibility）反映了这些机制共同作用下的调控状态，为描述细胞身份的 信使 RNA（messenger RNA, mRNA） 水平提供互补信息。分析染色质可及性谱，还能揭示单细胞 RNA 测序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq）可能无法捕捉的基因调控机制与细胞分化过程。

如上图所示，从染色质的高级结构到 DNA 化学修饰，多个层次的调控都会影响可及性。(1) 支架/基质附着区（Scaffold/Matrix Attachment Regions, S/MARs）以及核周的核孔复合物（Nuclear Pore Complexes, NPCs）、核纤层蛋白等，共同参与染色质的空间组织，影响其致密程度和基因表达 Narwade et al., 2019Buchwalter et al., 2019。(2, 3) 在局部尺度上，致密的异染色质（heterochromatin）与开放的常染色质（euchromatin）具有不同的可及性。ATP 依赖或非依赖的染色质重塑（chromatin remodeling）复合物，以及乙酰化、甲基化、磷酸化等组蛋白修饰，都能调节这一状态。(4) TF 结合也会影响核小体定位，并招募组蛋白修饰酶与染色质重塑因子。(5) 在 DNA 层面，CpG 位点的甲基化会影响 TF、组蛋白修饰酶等蛋白质的结合亲和力，这些作用可共同促使相应基因组区域沉默。还可观看 这段两分钟动画，了解表观遗传学与基因活性调控（由伊利诺伊大学 SQE 的 Nicole Ethen 制作）。关于基因组调控和 TF 活性的系统综述，可参阅 Isbel et al., 2022。

细胞的调控状态是决定细胞身份的重要因素。本部分聚焦染色质可及性数据，主要来自 单细胞转座酶可及染色质测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing, scATAC-seq），也包括 10x Multiome 测定（Assay，在同一细胞核中联合测量染色质可及性与 RNA）。

完成预处理后，可以利用这些数据：

1. 从不同于 scRNA-seq 的角度刻画细胞身份

2. 识别细胞状态特异的转录调控因子

3. 将基因表达与序列特征（sequence feature）联系起来

4. 解析驱动细胞分化和疾病状态的表观遗传机制

实验方法¶

商用试剂盒是目前广泛采用的实验方案。本书以 10x Multiome 数据演示分析；稍作调整后，同样适用于单模态 10x 单细胞 ATAC-seq 数据。

转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq） 利用 Tn5 转座酶探测开放染色质。以目标组织的单细胞悬液为起点，先提取细胞核，再在 bulk 条件下进行转座反应：Tn5 结合开放区域，同时切割 DNA 并接入测序接头。随后将细胞核加载到 10x Chromium Controller，生成包裹凝胶珠和单个细胞核的乳液微滴（Gel Bead-in-Emulsion, GEM）。微滴内的 RNA 分子和 DNA 片段被加上条形码（Barcode）；破乳后再进行预扩增及后续建库，得到 scATAC-seq 和 RNA 测序文库（library）。

下图展示了 scATAC-seq 的 DNA 片段化过程 Martens et al., 2022。Tn5 在开放染色质区域切割 DNA 并插入测序接头。两次插入可形成一个两端带接头的片段；插入方向十分重要，因为只有两端携带不同接头的片段才能被捕获并扩增。扩增后的片段经过双端测序（paired-end sequencing），再比对到参考基因组（reference genome）。

数据特点：feature 定义与稀疏性¶

scATAC-seq 覆盖整个基因组的编码区和非编码区，因此通常不能像 scRNA-seq 那样直接把基因作为预定义 特征（feature）。常见做法是寻找可及性高于背景的区域，也就是基因组上片段计数（Count）分布中的峰（peak）。基因区域的开放状态可提示转录潜能；非编码区的开放状态则可能是 TF 等调控蛋白结合的前提或结果。若汇总所有细胞后统一识别峰（peak calling），细胞类型特异的信号和稀有群体的信号可能被掩盖。为此，可以先在不依赖峰的表示上对细胞聚类（clustering），再分别识别各簇的峰。SnapATACFang et al., 2021 和 ArchRGranja et al., 2021 提出了基因组分箱（binning）策略：将整个基因组划分为等长窗口（bin），把这些窗口作为 feature 用于细胞聚类。

定义 feature 集合后，需要量化每个细胞在各 feature 中的 Tn5 信号。主要有三种策略：统计重叠的读段（Read）数、统计重叠的片段数，或将信号二值化（binarization）。10x Genomics 的 Cell Ranger ATAC 流程（pipeline）统计峰区域内的 Read，而 Signac Stuart et al., 2020 统计与 feature 重叠的片段。ArchR Granja et al., 2021 则统计 Read 末端，并在相应的默认分析流程中使用二值化表示。

按 Read 或片段计数会得到不同的 Count 分布。scATAC-seq 的双端测序为每个片段产生一对通常相距较近的 Read；若两端都落在同一 feature 内，该片段就贡献两个 Read。只有一端落在 feature 内时，才可能产生奇数 Count Martens et al., 2022。因此，按 Read 计数时，偶数 Count 往往远多于奇数 Count；按片段计数则没有这种成对累加的效应 Martens et al., 2022Miao & Kim, 2022。

scATAC-seq 数据还具有很高的稀疏性。在未复制、无拷贝数变异的二倍体常染色体区域，每个位点通常只有两份 DNA 模板，可贡献的独立片段数十分有限；峰或 bin 跨越较长区域，其 Count 则可大于 2。有限的模板和捕获效率使许多 feature 的 Count 为零，形成高度稀疏的计数矩阵（Count matrix）。一些方法将 Count 二值化：只要有一个 Read 或片段与 feature 重叠，就将其记为可及 Granja et al., 2021Bravo González-Blas et al., 2019Bravo González-Blas et al., 2019Ashuach et al., 2022。不过，二值化会丢失信号强度信息，可能降低对细微可及性差异的敏感度 Martens et al., 2022。

scATAC-seq 的最佳计数策略尚无定论，仍需更多独立基准测试。实际选择应结合研究问题与数据特点。

数据分析工作流概览¶

后续章节将介绍 scATAC-seq 分析的标准工作流（workflow）。下图概括了各分析阶段及常用框架之间的差异。首先使用 Python 和 muon 讲解质量控制（Quality Control, QC）与降维（dimensionality reduction）；随后演示如何将 muon 中的数据对象传入 R，并用 Signac 完成可视化与结果解读。

贡献者¶

我们衷心感谢以下人员的贡献：

作者¶

• Christopher Lance

• Laura Martens

审阅者¶

• Lukas Heumos