注释 - 单细胞最佳实践

步骤

yml

安装 conda：
- 在创建环境之前，请确保 conda 已安装在你的系统中。
保存 yml 内容：
- 将 yml 选项卡中的内容保存为文件 environment.yml。
创建环境：
- 打开终端或命令提示符。
- 运行以下命令：
```
conda env create -f environment.yml
```
激活环境：
- 创建好环境后，使用以下命令激活它：
```
conda activate <environment_name>
```
- 请将 <environment_name> 替换为 environment.yml 文件中指定的环境名称。该名称在 yml 文件中如下所示：
```
name: <environment_name>
```
验证安装：
- 通过运行以下命令，检查环境是否创建成功：
```
conda env list
```

surface_protein.yml

name: surface-protein
channels:
  - conda-forge
dependencies:
  - python=3.13
  - scanpy=1.12
  - muon=0.1.9
  - python-igraph=1.0.0
  - ipykernel=7.2.0
  - pip==26.0.1
  - pip:
      - lamindb==2.3.1
      - harmonypy==0.0.9
      - ipywidgets==8.1.8

本书使用 lamindb 存储、共享和加载数据集与笔记本，托管实例为 theislab/sc-best-practices。感谢提供免费托管的 Lamin Labs。

安装 lamindb
- 安装 lamindb Python 软件包：
```
pip install lamindb
```
可选择创建 Lamin 账户
- 按照说明注册并登录
验证你的设置
- 下面用 Python API 检查连接；命令行方式可使用 lamin connect：
```
import lamindb as ln

ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").df()
```
运行后应显示最多 100 条已保存的数据集记录。
访问数据集（Artifact）
- 在 Artifacts 页面搜索数据集
- 加载一个 Artifact 及其对应的对象：
```
import lamindb as ln
af = ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get(key="key_of_dataset", is_latest=True)
obj = af.load()
```
加载后的对象可直接在内存中分析。如需指定数据版本，可调整 lamindb.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get("SOMEIDXXXX") 中的 ID。
访问笔记本（Transform）
- 在 Transforms 页面搜索笔记本
- 加载笔记本：
```
lamin load <notebook url>
```
该命令将笔记本下载到当前工作目录。与 Artifacts 类似，可通过指定 ID 获取旧版本。

研究动机¶

抗体衍生标签（Antibody-Derived Tags, ADTs）提供表面蛋白信息，可补充单细胞 RNA 测序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq）的细胞类型注释（cell type annotation），尤其适合具有成熟表面标记体系的免疫细胞。RNA 测量可能出现漏检（dropout），即存在的转录本因采样或检测限制而未被记录；部分蛋白标记在 ADT 中信号更稳定，但 ADT 也有背景与检测局限。例如，多种免疫细胞表达 CD45 蛋白，而编码它的 PTPRC 转录本在个别细胞中可能较低或未检出，蛋白信息可帮助判断。

本章的手动注释（manual annotation）流程（workflow）沿用 Scanpy 的聚类（clustering）与可视化函数；不过，统计结果仍需按 ADT 的归一化（normalization）尺度解释，不能直接照搬 RNA 的全部假设。

环境设置¶

import warnings

import scanpy as sc

warnings.filterwarnings("ignore")
sc.settings.verbosity = 0
sc.set_figure_params(
    dpi=80,
    facecolor="white",
    frameon=False,
)

import lamindb as ln

ln.track()

→ connected lamindb: theislab/sc-best-practices
→ loaded Transform('BnpvfJLWjHuE0009', key='annotation.ipynb'), re-started Run('4qV0TQMofb5Skmfz') at 2026-07-29 14:38:23 UTC
→ notebook imports: lamindb-core==2.3.1 muon==0.1.9 scanpy==1.12.3
• recommendation: to identify the notebook across renames, pass the uid: ln.track("BnpvfJLWjHuE")

加载数据¶

加载前一章保存的 MuData 对象，参见批次校正：

af = ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get(
    key="surface-protein/cite_batch_correction.h5mu", is_latest=True
)
mdata = af.load()
mdata

手动注释¶

先查看白细胞常用标记 CD45。
CD45 通过调节 Lck 的磷酸化状态参与 T 细胞受体（T-Cell Receptor, TCR）信号调控 Courtney et al., 2019。本例预期多种免疫细胞均具有 CD45 信号，红系细胞通常较低；不同白细胞群的相对水平仍应结合数据观察，不能仅由这条信号通路推断。

sc.pl.umap(mdata["prot"], frameon=False, color="CD45", vmax=20)

数据中部分 ADT 名称可能因去重而带有后缀。var_names_make_unique 用于使变量名唯一，并不负责判断变量属于基因还是蛋白。蛋白名称可能出现 -1 等后缀；下面以 CD38 为例，在蛋白元数据中查找实际名称。

mdata["prot"].var[mdata["prot"].var.gene_ids.str.contains("CD38")]

先以较低分辨率进行 Leiden 聚类，识别主要群体。若有足够的标记和证据，再提高分辨率探索更细的亚群。

sc.tl.leiden(
    mdata["prot"],
    resolution=0.08,
    flavor="igraph",
    n_iterations=2,
    directed=False,
    random_state=0,
)

使用 Scanpy 的 rank_genes_groups 对簇间蛋白差异排序，并在 dotplot 中展示每簇排名靠前的三个标记。这里函数名沿用 genes，但输入是蛋白。下方代码请求 logfoldchanges；该统计量的近似计算面向对数归一化 RNA，而本例使用可为负的背景去噪与缩放（denoised and scaled by background, dsb）数值，因此不能将其直接解释为可靠的蛋白 log 倍数变化。注释还需检查实际标记信号。

sc.tl.rank_genes_groups(mdata["prot"], groupby="leiden")
sc.tl.dendrogram(mdata["prot"], groupby="leiden")
sc.pl.rank_genes_groups_dotplot(
    mdata["prot"], n_genes=3, values_to_plot="logfoldchanges"
)

CD3 支持将簇 0 和 1 初步识别为 T 细胞，CD19-1 支持将簇 6 识别为 B 细胞。接着在前面计算的统一流形近似与投影（uniform manifold approximation and projection, UMAP）上按簇着色。

sc.pl.umap(mdata["prot"], color="leiden")

结合多个已知免疫标记，核对各簇的候选细胞类型。

# B cells
sc.pl.umap(mdata["prot"], frameon=False, color=["CD19-1"])

簇 6 的 CD19 信号支持 B 细胞注释。

进一步结合 CD3、CD4 与 CD8，区分 CD4 和 CD8 T 细胞。

# T cells
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD3", "CD4-1", "CD8"])

随后检查自然杀伤细胞（Natural Killer Cells, NK cells）、CD14 单核细胞、树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）和 CD16 单核细胞的候选标记。应组合解读：CD56 也可出现在部分 T 细胞中，CD3 与 CD56 双阳性本身不足以确证 NKT；CD11c 也并非 DC 专属标记。

# NK cells are CD3- and CD56+
# NKT cells are CD3+ and CD56+
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD56"], frameon=False)

# CD14 Monocytes
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD11b", "CD14-1"], frameon=False, vmax=40)

# Dendritic cells. CD123 and CD303 are expressed mostly in dendritic cells, while CD11c is expressed in myeloid cells, including dendritic cells.
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD123", "CD303", "CD11c"], frameon=False, vmax=30)

# CD16 is expressed in NK cells and in CD16 monocytes, which are CD14-, CD16+ and CD11c+
sc.pl.umap(mdata["prot"], color="CD16", frameon=False)

根据标记组合，将簇编号替换为候选细胞类型名称。下方代码映射的是 0–8 共九个簇；其中两个簇都标为 DC。包括红系在内的各标签仍应由相应标记支持，不能仅凭单一阴性标记判断。

sc.pl.umap(mdata["prot"], color="leiden")

mdata["prot"].obs["celltype"] = mdata["prot"].obs.leiden.copy()
mdata["prot"].obs.celltype.replace(
    {
        "0": "CD4 T",
        "1": "CD8 T",
        "2": "Erythroid",
        "3": "CD14 Mono",
        "4": "NK",
        "5": "DC",
        "6": "B",
        "7": "DC",
        "8": "CD16 Mono",
    },
    inplace=True,
)

sc.pl.umap(
    mdata["prot"],
    color="celltype",
    legend_loc="on data",
    legend_fontsize=11,
    legend_fontoutline=2,
)

至此获得主要细胞群的初步注释。若需更细的分类，可提高聚类分辨率，再结合相应标记核对；分辨率提高并不自动意味着注释更准确。

本章基于通过测序进行转录组与表位索引（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing, CITE-seq）的 ADT 数据进行注释。联合利用 RNA 与蛋白信息的方法见配对整合章节。

af_annotation = ln.Artifact.from_mudata(
    mdata,
    key="surface-protein/cite_annotation.h5mu",
    description="CITE-seq data after annotation",
)
af_annotation.save()

→ creating new artifact version for key 'surface-protein/cite_annotation.h5mu' in storage 's3://lamin-eu-central-1/VPwcjx3CDAa2'
... uploading OyfKOZw9TXUQXeOp0006.h5mu: 100.0%
• replacing the existing cache path /var/cache/user/marchena/.cache/lamindb/lamin-eu-central-1/VPwcjx3CDAa2/surface-protein/cite_annotation.h5mu

Artifact(uid='OyfKOZw9TXUQXeOp0006', key='surface-protein/cite_annotation.h5mu', description='CITE-seq data after annotation', suffix='.h5mu', kind='dataset', otype='MuData', size=1450115558, hash='piMa8ZMc78O_eJtyyPlHCU', n_files=None, n_observations=105907, branch_id=1, created_on_id=1, space_id=1, storage_id=1, run_id=110, schema_id=None, created_by_id=7, created_at=2026-07-29 14:38:44 UTC, is_locked=False, version_tag=None, is_latest=True)

ln.finish()

• please hit CTRL + s to save the notebook in your editor ... ✓
→ finished Run('4qV0TQMofb5Skmfz') after 40s at 2026-07-29 14:39:03 UTC
→ go to: https://lamin.ai/theislab/sc-best-practices/transform/BnpvfJLWjHuE0009
→ to update your notebook from the CLI, run: lamin save /groups/nils/members/javier/single-cell-best-practices/jupyter-book/surface_protein/annotation.ipynb

自动注释¶

还可训练 ADT 分类器或映射到蛋白参考数据，但适用性取决于抗体面板、归一化方式、参考覆盖和跨批次可比性。本章不演示具体 ADT 自动注释模型；一般方法可参考 RNA 注释章节。

贡献者¶

我们衷心感谢以下人员的贡献：

作者¶

Javier Marchena-Hurtado
Daniel Strobl
Ciro Ramírez-Suástegui

审阅者¶

Lukas Heumos
Anna Schaar

References¶

Courtney, A. H., Shvets, A. A., Lu, W., Griffante, G., Mollenauer, M., Horkova, V., Lo, W.-L., Yu, S., Stepanek, O., Chakraborty, A. K., & Weiss, A. (2019). CD45 functions as a signaling gatekeeper in T cells. Sci. Signal., 12(604), eaaw8151.