免疫受体分析

免疫受体在细胞中的作用¶

免疫受体（Immune Receptors, IRs）参与识别抗原、病原相关成分及其他免疫信号，通常位于特定细胞的细胞膜上，并启动相应的免疫反应。其识别对象并不都来自外界，也包括自身成分和细胞状态变化。不同类型的 IR 识别不同的结构或信号：

• 模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）：识别病原体相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs）等信号。

• 杀伤细胞活化/抑制受体（Killer Activator/Inhibitor Receptors, KARs/KIRs）：感知宿主细胞表面配体的变化，参与识别异常细胞。

• 补体受体（complement receptor）：识别补体蛋白及其片段。

• Fc 受体：结合抗体的 Fc 区，参与识别抗体包被的靶标或免疫复合物。

• 细胞因子受体（cytokine receptor）：结合细胞因子。

• B 细胞受体（B-Cell Receptors, BCRs）：直接识别抗原表位。

• T 细胞受体（T-Cell Receptors, TCRs）：常规 αβ TCR 主要识别由主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）呈递的肽表位。

适应性免疫系统的受体¶

适应性免疫系统中，携带抗原受体的两大淋巴细胞谱系是 T 细胞和 B 细胞。两者的前体均起源于骨髓；T 细胞主要在胸腺成熟，B 细胞主要在骨髓成熟 Cooper & Alder, 2006。两类细胞的适应性免疫受体（Adaptive Immune Receptors, AIRs）可识别病原体、肿瘤及自身来源的抗原，但识别方式不同：BCR 直接结合可溶性或膜结合抗原的表位；常规 αβ TCR 则识别肽–MHC 复合体（peptide–major histocompatibility complex, pMHC），借助细胞表面的抗原呈递感知细胞内外的蛋白来源。这一描述不能直接概括所有 γδ TCR 或其他非常规 TCR。抗原刺激及相应的共刺激信号可促使 B、T 细胞活化和增殖，随后执行清除病原体、调节免疫应答或形成免疫记忆等功能。

通过 V(D)J 重组形成适应性免疫受体¶

TCR 的抗原识别部分由两条链组成，分别为 α/β 链或 γ/δ 链。BCR 的膜结合免疫球蛋白则由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻链分为 κ 和 λ 两型。两类受体均与相应的信号转导蛋白形成复合体。受体可变区由可变（variable, V）、多样性（diversity, D）和连接（joining, J）基因片段重组而成：α、γ、κ、λ 链使用 V 和 J 片段，β、δ 及免疫球蛋白重链还使用 D 片段。为简化表述，本书将这两类序列分别称为 VJ 链和 VDJ 链。

为识别广泛的抗原，AIR 具有极高的序列多样性。文献估计 TCR 潜在的序列空间可达 10²⁰ 量级，而单个人体内不同 TCR 序列的数量可达 10⁷ 量级 Zarnitsyna et al., 2013。BCR 的潜在多样性也有高达 10¹⁸ 的估计 Briney et al., 2019。这些估计的口径不同，不能将理论序列空间等同于一个人体内实际存在的受体数。一个个体所拥有的全部 AIR 构成其适应性免疫受体库（adaptive immune receptor repertoire, AIRR）。

V(D)J 重组通过以下机制产生序列多样性：

• 组合多样性（combinatorial diversity）：不同 V、D、J 基因片段的组合，以及不同 VJ 链与 VDJ 链的配对，共同增加受体种类。

• 连接多样性（junctional diversity）：基因片段连接处的核苷酸插入和切除产生额外的序列变化。

此外，活化 B 细胞增殖时，免疫球蛋白可变区还会发生体细胞高频突变（Somatic Hypermutation, SHM）。突变与后续选择共同促进亲和力成熟（affinity maturation）；并非每次突变都会提高抗原结合亲和力。

每条 AIR 链的可变区包含三个高度可变的互补决定区（Complementarity-Determining Regions, CDRs），即 CDR1–3，参与抗原识别。CDR1 和 CDR2 由 V 基因编码，CDR3 则跨越 V、D、J 或 V、J 的连接区域，因此通常最多样。VDJ 链的 CDR3 常被用作受体特异性的重要表征，但受体的结合特异性还取决于配对链及其他区域，不能仅凭一条 CDR3 序列确证。

VDJ 测序¶

细胞分离¶

进行单细胞测量前，需要根据研究目的富集并分离目标细胞。常用方法包括：

• 荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）：基于流式细胞术，先用荧光探针标记细胞悬液中的目标细胞。细胞随高速液流经过检测区，仪器逐个测量荧光信号；液流在振动作用下分成液滴，再通过对液滴充电和偏转完成分选。

• 磁激活细胞分选（Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS）：用连接抗体、酶、凝集素或链霉亲和素等分子的磁珠标记细胞，再施加磁场保留带磁珠的细胞，洗去其他细胞，最后收集目标群体。也可以采用负向分选：用一组标记物标记非目标细胞，将其磁性截留，并收集未被标记的目标细胞。这种方式无需直接标记目标细胞。

• 激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection, LCM）：根据显微镜下的形态定位组织切片中的细胞群或单个细胞，再选择性取出。系统通常包括显微镜、激光控制单元、载物台控制装置、CCD 相机和显示器。在热塑膜捕获方案中，激光脉冲局部熔化薄膜，使其黏附目标细胞以便取出。这种方法能尽量减少对周围组织的扰动，但不能保证完全没有损伤。

• 微流控（microfluidics）：在微小通道中处理细胞悬液，操作体积可低至纳升级。分离机制包括细胞亲和捕获、利用大小等物理性质、免疫磁珠以及介电性质差异。以亲和捕获为例，可在芯片表面固定抗体，使流过的目标细胞被捕获；洗去未结合成分后，再释放细胞供后续分析。微流控并不限于这一种分离机制 Hu et al., 2016。

免疫受体测序¶

一种获取单细胞 V(D)J 链序列的方法，是从全长单细胞 RNA 测序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq）数据中进行计算重建。常用的 Smart-seq2 是全长转录本方案，不能简单等同于只测量 5′ 端的表达定量方案。TRAPeS、TraCer 和 VDJPuzzle 可从 scRNA-seq 数据重建 TCR 序列；BALDR Upadhyay et al., 2018、BASIC Canzar et al., 2016 和 BraCer Lindeman et al., 2018 则用于恢复 BCR 序列。不过，短读长重建可能无法完整捕捉 V(D)J 区域的重组产物和可变剪接形式。为改善这一点，RAGE-seq 等方法将免疫受体转录本的靶向富集与 Oxford Nanopore 长读长测序（long-read sequencing）结合，以获取更完整的序列；同一实验的转录组部分则可使用 Illumina 等短读长平台测量 Singh et al., 2019。

AIR 库分析¶

单细胞 VDJ 测序可提供受体链的核苷酸序列及对应的氨基酸序列，并借助细胞标识关联 VJ 链与 VDJ 链。由此可注释 V、D、J、恒定区（constant, C）基因及 CDR3 序列。AIR 序列与 B、T 细胞的抗原识别能力密切相关，为研究细胞功能提供线索，但通常不能单凭序列直接确定靶抗原。AIR 信息主要可用于以下三类分析：

• 表型分析：根据相同或相似 AIR 将细胞分组，研究相关群体在不同条件下的变化，例如刺激后的转录组响应、克隆扩增（clonal expansion）或免疫应答前后的受体库多样性。序列相似可提示功能关联，但并不保证识别同一抗原。

• 序列分析：针对已识别的 AIR 群体，例如其他模态提示发生响应的细胞簇，分析 V、D、J 基因使用情况及富集的序列基序（motif），寻找与疾病或治疗相关的特征。

• 特异性推断：通过数据库匹配、序列距离或预测模型，为 AIR 提出候选靶抗原，定位可能对感染、肿瘤或自身抗原产生反应的细胞。结果仍需结合数据库证据、模型适用范围和实验验证解释。

数据集¶

本教程使用 Haniffa Lab 发布的数据集演示 IR 的预处理和分析方法 Stephenson et al., 2021。该研究围绕严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2），收集了 130 名参与者的超过 750,000 个外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的转录组数据，参与者包括感染者及对照。

数据来自 Newcastle、Cambridge 和 London 三个中心，涵盖无症状、轻度、中度、重度和危重症感染者，以及健康人、其他严重呼吸道疾病患者和静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）以模拟全身炎症反应的健康参与者等对照。数据还提供年龄、性别和吸烟状态等参与者层面的信息。

我们选择这一社区较熟悉的大规模单细胞数据集，是因为它同时包含 VDJ 测序信息。本教程分析其中具有 IR 注释的超过 150,000 个 B 细胞和 200,000 个 T 细胞。

运行以下命令下载数据：

加载数据¶

本教程主要使用以下两个 Python 包读取数据、按细胞整理信息并进行可视化：

• Scanpy：通用单细胞分析包（https://github.com/theislab/scanpy，Wolf et al., 2018）

• Scirpy：用于免疫受体分析的 Scanpy 扩展（https://github.com/scverse/scirpy，Sturm et al., 2020）

这里使用 Scirpy 演示 IR 分析。其他具有相关功能的工具包括 immunarch（R，ImmunoMind Team, 2019）、scRepertoire（R，Borcherding et al., 2020）、dandelion（Python，并整合部分 R 工具，Stephenson et al., 2021）和 Platypus（R，Yermanos et al., 2021）。工具比较可参阅 Valkiers et al., 2022。

先设置数据的输入与输出路径。

原始数据¶

先查看 Cell Ranger 流程（pipeline）的输出，了解数据结构。下面读取 filtered_contig_annotations.csv" 文件，每行对应一条组装序列（contig）的注释。原文文件名末尾多出的引号属于示例文本笔误；实际读取路径由代码变量指定。下方对 productive 列的类型转换仅修改当前 DataFrame，不会改写输入文件。

下面列出与预处理和分析相关的字段。Cell Ranger 的详细字段说明见官方文档（https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/8.0/analysis/outputs/cr-5p-outputs-annotations-vdj）。AIRR 标准等其他格式使用的字段名可能不同，但承载的信息大体对应。

• barcode：该 contig 所属细胞的条形码（Barcode）。

• is_cell：该 Barcode 是否被判定为细胞。

• high_confidence：该 contig 是否通过高置信度判定的布尔标记，并非校准后的概率。

• chain：受体链的类型，例如 TRA 为 TCR α 链，IGH 为免疫球蛋白重链。

• {v,d,j,c}_gene：受体 V、D、J、C 片段的基因注释。

• full_length：是否满足全长序列的判定条件，见下文。

• productive：是否满足 productive 的序列判定条件，见下文。

• cdr3{_nt}：cdr3 为 CDR3 的氨基酸序列，cdr3_nt 为其核苷酸序列。

• patient_id：参与者 ID。

Productive AIR 的判定¶

检测到 AIR 序列，并不意味着该序列一定能够编码完整受体。productive 表示序列满足相应的阅读框、起始密码子等判定条件；不满足的序列标为 non-productive。这是编码潜力的注释，不能证明受体具有功能性抗原结合能力。Scirpy 的默认分析通常不使用 non-productive 链；较新版本可将这些链保留在原始 AIRR 数据中，在链索引阶段排除，而不一定在读取时删除。10x Genomics 的 官方定义 包括以下条件：

• 序列跨越 V 基因到 J 基因。

• 前导区含有起始 密码子。

• CDR3 与起始密码子处于同一阅读框。

• V–J 区间内不存在同框终止密码子。

示例 1：序列未覆盖完整的 V–J 区间，对应 full_length 列为假。此类 contig 常缺少基因注释，尤其是 V 或 J 基因注释。

示例 2：contig 被标为 full_length，但缺少可识别的 CDR3，因此未被判为 productive。

下面读取 TCR 数据，将制表符分隔格式转换为逗号分隔格式，供后续使用。由于不同样本的 Barcode 可能重复，代码将跨样本唯一的 CellID 列移出原位置，作为 barcode 列。除 contig 注释外，数据还包含年龄、结局等参与者信息和细胞类型注释。

这份 TCR 数据已预先处理：示例中的 contig 均被标注为 full_length 和 productive。

按细胞整理数据¶

为进行细胞层面的分析，需要根据细胞条形码（cell barcode, CB），将逐条 contig 记录归并到对应细胞。一个细胞通常关联多条 contig，因为其受体包含 VJ 类链和 VDJ 类链；有些细胞还可能表达额外的受体链 Schuldt & Binstadt, 2019。

Scirpy 在读取受支持格式的受体数据时，会自动按细胞整理这些记录：

本章旧版示例将 IR 信息存放在 adata_tcr.obs 这一 pandas DataFrame 中，每行对应一个细胞。下面列出旧格式的字段；Scirpy v0.13 起主要将链记录保存在 .obsm["airr"]，并通过链索引选取用于分析的 VJ/VDJ 链，不能假定以下列在新版中仍直接存在。

• has_ir：是否检测到 IR。

• multi_chain：是否检测到超过两条 VJ 链或超过两条 VDJ 链，而非受体链总数是否超过二。

• extra_chains：旧格式中用于保存额外链的信息。

旧格式还将 contig 注释展开为列：分别记录 VJ 与 VDJ 两类链，每个细胞每类最多保留两条主要 contig，形成下列字段。这里的“两条”是每一链类别的上限，不是一个细胞全部链的总数上限。

• IR_V{D}J_{1,2}_locus

• IR_V{D}J_{1,2}_productive

• IR_V{D}J_{1,2}_{v,d,j,c}_call

• IR_V{D}J_{1,2}_junction{_aa}

读取受体数据时不会自动加入这些参与者注释。下面从原始表中提取相关字段，去重后以 Barcode 为索引，整理为细胞层面的注释表。

将注释表加入 AnnData 的 .obs；pandas 会按细胞索引对齐，然后检查结果。

同样读取 BCR 数据并检查 IR 注释。此处 read_10x_vdj 会重新读取输入文件，前面对 df_bcr_raw 的类型转换不会自动传递到这次读取。

再从 BCR 的 contig 表中提取参与者信息，去重并设置细胞索引。

将这些信息加入细胞注释：

质量控制¶

可靠分析需要质量合适的输入数据。应先识别受体信息不完整或链组合异常的细胞：

• 受体信息不完整：只检测到 VJ 或 VDJ 链，另一类链可能在测序或重建中遗漏。这些记录仍可能来自真实细胞，但不适用于需要完整配对受体序列的分析。

• 额外受体链：一个细胞可能检测到多条 VJ 或 VDJ 链。T、B 细胞天然表达双受体的情况已有报道 Schuldt & Binstadt, 2019。若检测到超过两条 VJ 链或超过两条 VDJ 链，则应警惕双细胞（Doublet）或其他技术问题；额外一条链本身并不足以确证 Doublet。

汇总每个细胞的受体链后，可以标记其链配对状态，再按下游任务选择合适的细胞。不同分析对链信息完整性的要求并不相同。

标记 AIR 状态¶

chain_qc 生成受体类型、亚型和链配对状态三类注释。主要取值如下：

• chain_pairing（链配对状态）

  • orphan {VJ}/{VDJ}（孤链）：只检测到一条 VJ 链或一条 VDJ 链。

  • single pair（单对）：检测到一条 VJ 链和一条相匹配的 VDJ 链。

  • extra {VJ}/{VDJ}（额外链）：在一对 VJ/VDJ 链之外，还检测到一条额外的 VJ 或 VDJ 链。

  • two full chains（两对链）：检测到两条 VJ 链和两条 VDJ 链，且类别相匹配；这类注释不能单独证明每条链在细胞内的实际物理配对。

  • multichain（多链）：超过两条 VJ 链或超过两条 VDJ 链，提示可能存在 Doublet。

• receptor_type（受体类型）：包括 BCR、TCR、no IR（无受体）和 ambiguous（类型不明确，如同时包含 TCR 与 BCR 链）；较新版本还会单列 multichain。

• receptor_subtype（受体亚型）：区分 αβ、γδ TCR 及含 κ 或 λ 轻链的 BCR 等组合；实际字符串标签以所用 Scirpy 版本为准。

可视化¶

不同样本、采集中心或数据来源的链配对质量可能不同，应按这些分组查看各类状态的分布。下面比较三个采集中心的数据。

三个中心都以 single pair 细胞为主，说明多数细胞获得了一对受体链。比较不同中心时，可进一步查看各状态的细胞比例，以减少总细胞数差异对图形的影响：

本例三个中心的链配对组成总体相近：single pair 最多，其次是 orphan VDJ 和 orphan VJ。原教程将单对受体超过 60%、孤链约 10–20%、额外链约 10% 作为示例性参考，这些比例不是适用于所有实验的固定质控阈值。多模态测序中，无 AIR 信息的细胞比例还取决于样本中不表达这类受体的细胞占比，以及受体捕获效率。

第一张图主要显示 TCR，符合这里已将 T、B 细胞数据分开处理的设置；本例检出的 TCR 为 αβ 型。无 AIR 信息的细胞比例太小，难以从图中辨认，因此再查看绝对数量。原教程输出中，这类细胞为 22 个；在包含其他细胞类型的多模态数据中，该比例可能更高。

对 BCR 按参与者比较。为便于展示，下面选择 COVID-003 和 AP11 两名参与者的细胞；这一步是指定参与者取子集，并非随机下采样。

两名参与者的 B 细胞数量差异较大，但链配对状态的比例相近。

该子集同样只包含一种受体类型，即 BCR；不同细胞分别使用 κ 或 λ 轻链。

过滤¶

是否按 AIR 状态过滤，取决于研究所需的信息以及可接受的数据量损失。常见做法是保留全部细胞及状态标签，在各项下游分析前再选择可用记录。例如，仅用 VDJ 链的 CDR3 查询数据库时可以纳入 orphan VDJ；若查询需要完整配对受体，则必须同时具备 VJ 和 VDJ 信息。原文此处的“第 X 章”是尚未补全的交叉引用。下面演示不同过滤条件，可按具体任务选择应用时机。

可以采用不同严格程度的条件，或组合多个条件：

• has IR（具有受体）：保留检测到 IR 的细胞，因为无受体序列的细胞无法参与相应的序列分析。

• no multi chains（排除多链）：排除超过两条 VJ 链或超过两条 VDJ 链的疑似 Doublet。

• only one AIR（仅保留一组受体）：排除两组链或额外链记录，以减少特异性归属到具体受体时的歧义。

• no single chains（排除孤链）：排除只具有 VJ 或 VDJ 信息的细胞，适用于要求完整链配对的分析。

本书后续仍使用完整数据，因此这里将逐步过滤的结果存入临时 AnnData 对象，并打印每一步保留的细胞数。注意：下面原始示例用 "multi_chain" 比较 chain_pairing，而 Scirpy 的分类值为 "multichain"；两者不一致时，这一步不会排除预期记录。运行时应先核对实际类别。后续筛选 single pair 才会明确只保留单对链记录。

最后的临时对象只保留 single pair 的 BCR 记录。严格过滤可能显著减少可用细胞，进而限制下游分析。

TCR 数据可按相同顺序过滤；同样需要注意上面说明的 multichain 字符串差异。

最后保存带有受体状态注释的完整 adata_tcr 和 adata_bcr，供后续分析使用；此处保存的不是上面的临时过滤对象。

测验¶