注释

39. 注释#

39.1. 动机#

与 scRNA-seq 数据类似，也可以基于表面蛋白标记对 ADT 数据进行注释。这对免疫细胞的注释尤其有益，因为免疫细胞在 RNA 层面很难注释，而它们的表面蛋白却能很好地刻画它们。scRNA-seq 数据可能存在 dropout（基因漏检）：即某个基因虽然在某个细胞群中表达，但由于测序流程的限制，在部分细胞中却检测不到。相比之下，由于 ADT 使用抗体来定量表面蛋白，受 dropout 的影响要小得多。因此，单个表面蛋白在 ADT 数据中的信号比在 RNA 数据中更强。

例如，尽管被测序的免疫细胞通常包含 CD45 阳性细胞，但 CD45 基因在 RNA 数据中并不总是高表达。通过（额外）在 ADT 层面进行注释，可以缓解这一问题。

一般的注释流程使用与 RNA 数据相同的函数，不需要 ADT 特有的函数。

39.2. 环境设置#

import warnings

import muon as mu
import scanpy as sc

warnings.filterwarnings("ignore")
mu.set_options(pull_on_update=False)
sc.settings.verbosity = 0
sc.set_figure_params(
    dpi=80,
    facecolor="white",
    frameon=False,
)

import lamindb as ln

ln.track()

→ loaded Transform('BnpvfJLWjHuE0005', key='annotation.ipynb'), re-started Run('QEKKxvVQBGXwIHKf') at 2026-04-10 17:37:56 UTC
→ notebook imports: lamindb-core==2.3.1 muon==0.1.7 scanpy==1.12
• recommendation: to identify the notebook across renames, pass the uid: ln.track("BnpvfJLWjHuE")

39.3. 加载数据#

我们载入上一章批次校正末尾保存的 MuData 对象：

af = ln.Artifact.connect("theislab/sc-best-practices").get(
    key="surface-protein/cite_batch_correction.h5mu", is_latest=True
)
mdata = af.load()
mdata

MuData object with n_obs × n_vars = 117951 × 36737
  var:	'gene_ids', 'feature_types'
  2 modalities
    rna:	117951 x 36601
      obs:	'donor', 'batch'
      var:	'gene_ids', 'feature_types'
    prot:	117951 x 136
      obs:	'donor', 'batch', 'n_genes_by_counts', 'log1p_n_genes_by_counts', 'total_counts', 'log1p_total_counts', 'n_counts', 'outliers', 'doublets_markers'
      var:	'gene_ids', 'feature_types', 'n_cells_by_counts', 'mean_counts', 'log1p_mean_counts', 'pct_dropout_by_counts', 'total_counts', 'log1p_total_counts'
      uns:	'batch_colors', 'donor_colors', 'doublets_markers_colors', 'neighbors', 'pca', 'umap'
      obsm:	'X_pca', 'X_pca_harmony', 'X_umap'
      varm:	'PCs'
      obsp:	'connectivities', 'distances'

39.4. 手动注释#

首先，我们检查 CD45 的表达。CD45 是 T 细胞质膜上最丰富的蛋白之一，是 TCR 信号传导所必需的。它会激活 Lck，而 Lck 又是磷酸化 TCR 复合体所必需的 [Courtney et al., 2019]。因此，CD45 应在我们的数据集中广泛表达，并在 T 细胞中表达得更高。

sc.pl.umap(mdata["prot"], frameon=False, color="CD45")

../_images/4f7000e2cd1b5b04cae78d0768c78eda2f08d8ef0cf4c4cb5055d33f711657e6.png

由于与 RNA 基因存在名称冲突，所测量的 ADT 使用的命名略有不同。var_names_make_unique 函数用于将基因名与蛋白质名分离，蛋白质可能带有 -1 后缀。我们查找一个示例基因名（CD38），以此示例性地确定其在变量名中的确切命名：

mdata["prot"].var[mdata["prot"].var.gene_ids.str.contains("CD38")]

	gene_ids	feature_types	n_cells_by_counts	mean_counts	log1p_mean_counts	pct_dropout_by_counts	total_counts	log1p_total_counts
CD38-1	CD38	Antibody Capture	116434	52.892694	3.986995	4.57481	6453755.0	15.680173

我们以相对较低的分辨率对细胞进行聚类。与 scRNA-seq 数据注释类似，也可以提高分辨率以获得更精细的注释。

sc.tl.leiden(
    mdata["prot"],
    resolution=0.1,
    flavor="igraph",
    n_iterations=2,
    directed=False,
    random_state=0,
)

为了检查哪种细胞类型中存在哪些表面标记，我们使用 scanpy 的 rank_genes_groups() 函数，然后绘制一张点图（dotplot）。该点图会标出每个聚类中差异表达最显著的 3 个基因。

sc.tl.rank_genes_groups(mdata["prot"], groupby="leiden")
sc.tl.dendrogram(mdata["prot"], groupby="leiden")
sc.pl.rank_genes_groups_dotplot(
    mdata["prot"], n_genes=3, values_to_plot="logfoldchanges"
)

../_images/6c843e093ed726898596af661a05b520b03876a6d077138f279fffbd5c26e5d5.png

我们已经可以通过 CD3 的表达把第 0 和第 2 类识别为 T 细胞群，并通过 CD19 的表达把第 7 类识别为 B 细胞。接下来，我们绘制前几章中计算得到的 UMAP，并按聚类进行着色。

sc.pl.umap(mdata["prot"], color="leiden")

../_images/bfc3a60fcf9a3025a68047f82d5396c8a25f2d298e2f92a992848dfbbec804a0.png

我们将检查几个已知的主要免疫细胞类型的标记，以确定每个聚类对应的是哪种细胞类型。

# B cells
sc.pl.umap(mdata["prot"], frameon=False, color=["CD19-1"])

../_images/8cbd5e96e01762c3365ca6d6e6cae11fea5197573439b2db60c627f35f755e8b.png

正如点图中所示，第 7 类表达 CD19，这是一个 B 细胞标记。

下面我们更详细地考察 T 细胞，并把它们分成 CD4 和 CD8 细胞。

# T cells
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD3", "CD4-1", "CD8"])

../_images/b90710ae256e8056d74c950e1d6ace8925c2cff1183a2c1356d34c2e9a0861b5.png

在接下来的几张图中，我们继续寻找其他细胞类型的已知标记：NK 细胞、单核细胞和树突状细胞。

# NKT cells are CD3+ and CD56+
# NK cells are CD3- and CD56+
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD56"], frameon=False)

../_images/5ba2df062c9783df805c5547261f531158094d6f5e874f37ad57f92075d83b13.png

# Monocytes
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD11b", "CD14-1"], frameon=False)

../_images/cbc3e41c7bb837814f8dfa2c98b90f49e18ea041c56aac21d392c51f183d9a6d.png

# Dendritic
sc.pl.umap(mdata["prot"], color=["CD123", "CD11c", "CD303"], frameon=False)

../_images/cc99922e51ab8a2836abf1c808f263cfcef134f64f72aad4af6b2368e89548db.png

# CD16 is expressed in NK cells and in CD16 monocytes, which are CD14-, CD16+ and CD11c+
sc.pl.umap(mdata["prot"], color="CD16", frameon=False)

../_images/71c4b3f5b00bceb8d04a425b20c6be372a73dbb11c5b9ff10788309d95615dcc.png

现在我们已经知道每个聚类对应哪种细胞类型，下面就用真实的细胞类型名称来替换 0–8 这些聚类编号：

mdata["prot"].obs["celltype"] = mdata["prot"].obs.leiden.copy()
mdata["prot"].obs.celltype.replace(
    {
        "0": "CD4 T",
        "1": "Cytotoxic T",
        "2": "CD8 T",
        "3": "CD14 Mono",
        "4": "Proliferating cells",
        "5": "DC",
        "6": "CD16 Mono",
        "7": "B",
        "8": "NK",
    },
    inplace=True,
)

sc.pl.umap(
    mdata["prot"],
    color="celltype",
    legend_loc="on data",
    legend_fontsize=11,
    legend_fontoutline=2,
)

../_images/4e17cdab8bdcdb7e7d8115d78c3eb5ead88008d8bbb748f4ca0f5b283e97dfe5.png

我们已经发现并注释了数据中的主要细胞类型。现在，我们可以通过提高聚类分辨率、并对由此得到的精细聚类进行注释，来做更精细的注释。

在本章中，我们介绍了如何基于 CITE-seq 的 ADT 数据对细胞类型进行注释。另一个有意思的方向是结合 ADT 和 RNA 数据的信息来注释细胞类型。请参阅配对整合章节。

af_annotation = ln.Artifact.from_mudata(
    mdata,
    key="surface-protein/cite_annotation.h5mu",
    description="CITE-seq data after annotation",
)
af_annotation.save()

ln.finish()

39.5. 自动注释#

从技术上讲，可以使用在 ADT 数据上训练的细胞类型分类器，并对照 ADT 参考数据集进行映射。然而，专门针对 ADT 的方法很少，甚至几乎没有；关于方法学细节，请参阅 RNA 注释一章注释。

39.6. 参考文献#

[CSL+19]

Adam H Courtney, Alexey A Shvets, Wen Lu, Gloria Griffante, Marianne Mollenauer, Veronika Horkova, Wan-Lin Lo, Steven Yu, Ondrej Stepanek, Arup K Chakraborty, and Arthur Weiss. Cd45 functions as a signaling gatekeeper in t cells. Sci. Signal., 12(604):eaaw8151, October 2019.

39.7. 贡献者#

我们衷心感谢以下人员的贡献：

39.7.1. 作者#

Javier Marchena-Hurtado
Daniel Strobl
Ciro Ramírez-Suástegui

39.7.2. 审阅者#

Lukas Heumos
Anna Schaar

注释

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